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          當前位置:首頁(yè) > 單細胞測序

          什么是單細胞測序

          單細胞測序(single cell sequencing)是指在單個(gè)細胞水平上,揭示全基因組范圍內的所有基因表達情況,包括鑒定組織細胞類(lèi)型,反映不同樣本間的細胞異質(zhì)性和組織微環(huán)境,讓您真正了解一塊Bulk組織的每一個(gè)細胞的真實(shí)狀態(tài)和關(guān)聯(lián),呈現更加真實(shí)和全面的細胞世界。 2013年,單細胞測序技術(shù)被《Nature Methods》列為年度技術(shù),同年位居《Science》年度最值得關(guān)注的六大領(lǐng)域榜首;2015年再登Science轉化醫學(xué)封面,2018年位居《Science》十大科學(xué)突破榜首。目前,單細胞測序技術(shù)在腫瘤、發(fā)育生物學(xué)、微生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、以及植物學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用,已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的焦點(diǎn)。

          烈冰單細胞測序優(yōu)勢

          烈冰單細胞測序為了準確快速地進(jìn)行單細胞測序研究,基于前沿的研究文獻進(jìn)行多重優(yōu)化,真正做到準確可靠全面的單細胞測序解析

          • 10X Genomics
          • BD Rhapsody
          • PanoCell
          • BD FACSMelody

          10X Genomics單細胞捕獲平臺起源自Drop-Seq技術(shù),通過(guò)"雙十字"微流控系統形成一個(gè)個(gè)含有細胞和凝膠微珠(aelbead)的油包水的乳滴(GFMs),其核心技術(shù)在干凝膠微珠美面的引物序列,由標記細胞的Barcode、標記細胞內mRNA的UMI和捕獲mRNA的PolvdT組成。10X Genomics ChromiumTM系統可實(shí)現數千至數百萬(wàn)個(gè)單細胞的分析,解決常規scRNA-seq在通量或擴展性方面存在的不足。

          BD Rhapsody?單細胞分析系統的誕生基于 BD 在細胞生物學(xué)領(lǐng)域 40年的專(zhuān)業(yè)技術(shù), 采用CytoSeq特有的蜂窩板技術(shù)進(jìn)行單細胞捕獲。該技術(shù)用20W+的微孔(該數量級遠大于Input細胞數量),保證單孔中的單細胞捕獲。同時(shí)避免了傳統微流控系統中存在的概率碰撞影響捕獲效率的問(wèn)題,采用微孔捕獲相對會(huì )有更好的捕獲效率,保證Input細胞的全面使用。

          烈冰“智造”P(pán)anoCell V2.0版微孔芯片,全面升級外觀(guān)、捕獲材質(zhì)、微孔精密程度、細胞落孔率和細胞捕獲效率,提供自研蜂巢板+BD平臺原裝進(jìn)口單細胞分選試劑+華大T7超高通量測序儀的服務(wù)新方案,達到準確穩定的單細胞實(shí)驗結果,媲美BD原裝的平臺服務(wù)實(shí)力,烈冰智造一直不斷努力提高新產(chǎn)品和服務(wù)水平,以提供更高效、成本更低的國產(chǎn)化單細胞捕獲方案!

          BD FACSMelody?細胞分選儀結合BD高端分選儀技術(shù)與智能自動(dòng)化軟件,將簡(jiǎn)便易用的分選儀推向一個(gè)新高度。便捷的操作可幫助節約儀器調試的時(shí)間,并且提供質(zhì)量可重復的檢測結果。BD FACSMelody?細胞分選儀讓更多的研究者可以使用復雜的流式細胞儀和分選技術(shù)獲得更想要的細胞,提高實(shí)驗室效率。

          樣本要求

          樣本類(lèi)型

          組織、血液、培養的細胞系、制備好的單細胞懸液
          注:若客戶(hù)樣本為組織,且尚未成功將組織樣本消化成單細胞懸液,烈冰將盡可能提供技術(shù)及實(shí)驗上的幫助,但因不同類(lèi)型樣本的特異性,無(wú)法保證實(shí)驗方法適用于所有類(lèi)型組織。

          質(zhì)量要求

          細胞活性大于70%,濃度為500-2000細胞/μl,
          體積不小于200μl,細胞培養基及緩沖液不能含Ca2+和Mg2+,細胞體積小于40μm。


          實(shí)驗流程

          結果示例

          細胞數量判斷

          采用Fastp軟件對下機原始數據進(jìn)行質(zhì)控,對質(zhì)控后測序數據中的cell barcode信息及其對應的counts數進(jìn)行統計,判斷測序樣本中實(shí)際檢測到的細胞數量,獲得樣本的測序細胞數,并根據最終確認的cell barcode信息提取對應的reads。

          注:橫坐標為細胞數量,縱坐標為每個(gè)細胞對應的平均counts數,根據曲線(xiàn)的斜率判斷實(shí)際檢測的細胞數量

          基因組比對和表達量統計

          以cell barcode對應的reads為研究對象,采用STAR算法將測序數據比對到物種對應的基因組上,獲得基因組比對的bam文件。再以bam文件以及基因組注釋文件為研究對象,將比對到同一基因上的UMI進(jìn)行合并,并去除其中重復的UMI序列,得到每個(gè)基因的UMI數量,統計每個(gè)細胞中檢測到的基因數以及轉錄本數量,并得到表達量矩陣表。

          注:左圖為細胞中總共檢測到的基因數量,右圖為去除重復UMI后統計的基因數量

          細胞過(guò)濾和數據標化

          利用基因組比對結果以及表達量結果對測序檢測到的細胞進(jìn)行過(guò)濾,去除細胞中基因檢測數少、線(xiàn)粒體基因占比大的細胞,統計過(guò)濾后的細胞數量并得到對應的表達量矩陣表。采用數據標準化方法(CPM/RLE/UQ/TMM/scran/Downsampling等),對不同樣本中細胞基因表達量進(jìn)行標準化,得到標準化后的表達量矩陣表。

          注:橫坐標表示每個(gè)細胞中UMI的數量,縱坐標表示線(xiàn)粒體基因的占比情況

          細胞亞群分析

          基于每個(gè)細胞中的基因表達量數據,采用聚類(lèi)算法對細胞進(jìn)行亞群分析,同時(shí)采用t-SNE分析對細胞的分群結果進(jìn)行可視化展示。同時(shí),還可以對不同樣本中各細胞亞群的占比情況進(jìn)行統計分析。

          Chen, et al.Nature?Cell?Biology, ?2021 Jan;23(1):87-98.
          注:左圖為前列腺腫瘤組織細胞亞群鑒定t-SNE圖展示;右圖細胞亞群分群情況

          Marker基因鑒定

          鑒定不同細胞亞群中的Marker基因,并對Marker基因的表達分布進(jìn)行可視化展示。

          Zhang et al., Glia. 2021 Mar;69(3):765-778.
          注:?marker基因的Feature Plot圖和Violin圖

          差異基因篩選

          針對所有或者特定細胞亞群,進(jìn)行細胞亞群間差異表達基因篩選,獲得細胞亞群間差異表達基因。

          Zhang, et al. Glia.?2021 Mar;69(3):765-778.
          注:該圖為不同細胞亞群間差異基因聚類(lèi)分析Heatmap圖

          功能分析(GO Analysis)和信號通路分析(Pathway Analysis)

          分別采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO數據庫,以及KEGG數據庫,對Marker基因/差異基因進(jìn)行功能分析和信號通路分析,從而得到這些基因群體所顯著(zhù)性富集的GO條目和Pathway條目。

          Zhang C, et al. J Immunother Cancer 2021;9:e002312.
          注:該圖為不同cluster之間差異基因顯著(zhù)富集的GO/Pathway條目

          SCENIC分析

          基于已知的轉錄因子靶點(diǎn)數據庫,以及轉錄因子和靶基因的表達矩陣,采用SCENIC算法,對于轉錄因子的調控網(wǎng)絡(luò )進(jìn)行計算,得到在每一個(gè)細胞中表達的轉錄因子的調控基因以及調控強度。

          Chen, et al. Nature Communication 2020;?11:5077
          注:該圖為不同cluster之間轉錄因子調控強度heatmap圖

          QuSAGE分析

          基因集表達激活度定量分析,采用方差膨脹因子(VIF)診斷共線(xiàn)性的方法對于諸如KEGG基因集、GSEA基因集、甚至研究者自己搜集的基因集在Cluster中的富集度進(jìn)行分析,比較不同Cluster所富集的基因集的差異。

          Chen, et al.Nature?Cell?Biology, ?2021 Jan;23(1):87-98.
          注:該圖為不同cluster之間信號同理調控強度熱圖

          高級數據分析

          擬時(shí)序分析

          以細胞的表達量數據為研究對象,采用TSCAN/monocle/SLICER/Ouija等算法,在虛擬時(shí)間軸上對細胞的變化模式進(jìn)行分析,模擬重建細胞的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程,獲得細胞間的狀態(tài)轉換關(guān)系,以及不同狀態(tài)細胞間差異基因的表達情況。

          Chen, et al.Nature?Cell?Biology, ?2021 Jan;23(1):87-98.
          注:細胞間狀態(tài)轉換的pesudotime軌跡圖(左)、軌跡中細胞占比餅圖(左下) 和?Heatmap圖(右)

          細胞通訊分析

          以細胞亞群的基因表達量數據為研究對象,獲得細胞中的配體及受體基因的表達信息,采用Cellphone DB算法以及數據庫,得到細胞亞群間的信號通訊關(guān)系,并計算獲得關(guān)系的顯著(zhù)性和強度。

          Chen, et al. Nature Communication 2020;?11:5077
          注:左圖:橫坐標表示細胞類(lèi)型,縱坐標表示細胞間通訊配受體關(guān)系,圓圈大小表示顯著(zhù)性差異水平,圓圈顏色越紅表示細胞間通訊關(guān)系越強

          TCGA預后聯(lián)合分析

          以TCGA臨床信息以及篩選到的關(guān)鍵基因為研究對象,結合TCGA臨床數據,進(jìn)行預后分析,獲得該基因/基因集與臨床預后之間的關(guān)系。

          Zhang C, et al. J Immunother Cancer 2021;9:e002312.
          注:橫坐標表示生存期,縱坐標表示占比,不同顏色曲線(xiàn)代表不同分組

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