說到癌癥，每個人都聞風喪膽，對于科研工作者來說，也是一直重點關注的對象。癌癥中l(wèi)ncRNA的研究，曝光度非常之高。近日，來自南京醫(yī)科大學的研究團隊在知名期刊Nucleic Acid Resrarch在線發(fā)表了一篇有關lncRNA的文章，其中測序和生信分析工作由烈冰協(xié)助完成。

研究背景

ESCC（esophageal squamous cell carcinoma，食管鱗狀細胞癌）是發(fā)生于食管，向鱗狀上皮分化的惡性腫瘤，占食管癌的絕大多數(shù)。LncRNA CCAT1（colon cancer associated transcript 1，結腸癌相關轉錄物-1）在很多種類的癌癥中被研究過，但在食管鱗狀細胞癌中的功能一直沒有被證實。該研究主要是針對lncRNA CCAT1在ESCC中的調節(jié)機制開展的。

研究結果

研究者發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細胞癌中l(wèi)ncRNA CCAT1的表達顯著增加，ChIP-qPCR證實H3K27乙?；せ頒CAT1的表達。進一步的體外和體內實驗均證實CCAT1的敲低顯著抑制了細胞的增殖和遷移。RNA-Seq分析證實CCAT1的敲低優(yōu)先影響的基因都和細胞的增值、遷移、粘附有關。細胞核中，CCAT1調節(jié)SPRY4（sprouty RTK signaling antagonist 4）啟動子區(qū)域的組蛋白甲基化；細胞質中，CCAT1競爭結合miR-7（一種靶向作用于CCAT1和HOXB13的microRNA），從而調控HOXB13（homeobox B13，HOX基因之一，可以促進癌細胞的增殖和遷移）促進細胞增值和遷移。

為了準確找到ESCC中與CCAT1相關的通路，烈冰協(xié)助研究者對用si-CCAT1轉染的Eca-109細胞進行了轉錄組測序分析。

生信分析思路

圖1. CCAT1敲低后Eca-109細胞的轉錄組測序分析思路

差異基因分析結果

圖2.si-NC處理的細胞和si-CCAT1處理的細胞差異基因表達的聚類圖（差異倍數(shù)≥1.5倍），具有三個生物學重復

GO分析結果

圖3.表達改變的基因的GO分析

從圖3中不難看出，最顯著富集的生物學過程主要涉及細胞增殖、細胞遷移、細胞粘附以及細胞凋亡。這些包括許多著名的和細胞增殖、遷移相關的基因，如HPGD, ADAM19, CASP14, IGFBP1, FAT4, SPRY4,KLF6, BTG2, IGFBP3, GDF15, FAS, p15, p27, COX17,ATF4, JUND, HOXB13, CDC25B, CCND3, MMP14,MMP28,MAPK4，AQP8等。

結果驗證

為了進一步確認CCAT1的功能，研究者設計了qRT-PCR的驗證實驗，在兩個不同的細胞系中證實了敲低或者過表達CCAT1能夠影響上述相關基因的表達。（圖4）

圖4. 通過qRT-PCR實驗，證實在CCAT1敲低（siRNA和ASO）和CCAT1過表達中mRNA的改變

很多研究證實大量lncRNA與染色質修飾酶共同作用促進表觀遺傳活化或基因表達沉默，為了探究CCAT1介導的調控機制，研究者又進行了一系列實驗，最終發(fā)現(xiàn)用ASO敲低CCAT1后降低了SPRY4啟動子區(qū)域甲基化水平，CCAT1過表達可以增加甲基化水平，從而證實CCAT1能夠調控SPRY4，通過抑制SPRY4的表達，影響食管癌細胞的生長和遷移。

圖5. SPRY4的表達受CCAT1調控，且其過表達會抑制ESCC細胞的增殖和轉移

RNA-Seq發(fā)現(xiàn)CCAT1的敲低明顯減少一系列促進ESCC增殖和遷移的基因。HOXB13是HOX基因之一，可以促進癌細胞的增殖和遷移。研究者在蛋白水平證實了這些結論，qRT-PCR分析也發(fā)現(xiàn)HOXB13在ESCC組織中顯著上調。進一步分析表明，CCAT1與HOXB13表達呈正相關（圖6A）。為了探討CCAT1調控HOXB13表達的機制，研究者又進行了熒光素酶測定等一系列實驗，發(fā)現(xiàn)它們的調控機制跟miR-7有關，CCAT1的敲低使miR-7的表達增加，但CCAT1過表達使miR-7的表達減少（圖6B）。miR-7可以靶向結合CCAT1和HOXB13，CCAT1的敲低明顯降低HOXB13 3’UTR的熒光素酶強度，可見CCAT1是HOXB13豐富表達所必需的（圖6C）。

圖6. CCAT1在細胞質中通過競爭結合miR-7促進HOXB13表達，從而促進ESCC細胞生長和遷移

結論

該研究證實了CCAT1啟動子的乙酰化促進了ESCC中CCAT1的上調。與mRNA類似，lncRNAs的轉錄受到典型的表觀遺傳學調控和轉錄因子介導的調控。在體外與體內的研究也發(fā)現(xiàn)下調CCAT1的表達可以抑制ESCC細胞的增殖和遷移，同時， CCAT1介導的組蛋白甲基化（H3K9me3和H3K9me3）也可以抑制SPRY4在癌癥中的表達（SPRY4在很多癌癥中表現(xiàn)出抑癌基因的功能）。

圖7. CCAT1在ESCC內增殖和遷移過程的模型

研究者最終證實，CCAT1可以促進ESCC細胞的增殖和遷移。在細胞核中，CCAT1可通過表觀遺傳學調節(jié)SPRY4的轉錄來實現(xiàn)該功能；在細胞質中，則可通過競爭結合miR-7，從而促進ESCC的細胞存活和轉移。CCAT1在ESCC的腫瘤發(fā)生中可能表現(xiàn)出不同的調控機制。（圖7）

原文鏈接：www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5389582/pdf/gkw1247.pdf